对于常常游走在分子实验室的童鞋们来说，看似简单的「试剂配制——上机——出结果」的 QPCR 检测流程，实则险象迭生，有时一丢丢的差错可能都会让我们怀疑人生。

经常被 QPCR 实验莫名其妙的结果折磨的你，是不是一遍又一遍地探索过原因？

01  试剂准备

QPCR 预混液、引物、探针等常保存在 -20℃ 冰箱，从冰箱取出后溶液常处于部分结晶状态，如果此时带有侥幸心理，用移液器一量，可以吸到所需体积的溶液，就直接拿去配制，那很遗憾，实验多半不会成功。

敲黑板

必须等待溶液完全解冻并涡旋混匀后方可使用，原因是 QPCR 预混液是由多种成分按照一定的浓度及比例混合而成的，在未完全解冻的状态下吸取溶液的成分、浓度都是随机的，那自然实验成功率也是随机的。

02  试剂配制（除模板外）

1）首先我们需要计算出每种成分所需配制样本量的总体积，建议在所需体积的基础上×1.1 或 1.2 倍，以弥补移液过程中的损失，如下（N 为样本总数，包括对照）：

2）移液需选择合适量程的移液器，规范移液操作，移液过程中采用质量较好的枪头，以减少吸头中液体挂壁带来的误差。

3）配制好的溶液要求吸打混匀或者涡旋混匀，使溶液充分混合。

4）在冰盒或低温金属浴上配制分装，可减少气泡的产生。

03  试剂分装

将混匀后的混合液分装至 QPCR 检测所用的耗材中，常为 PCR 八连排管或 96 孔板。

1）PCR 管

耗材必须选择与 QPCR 仪相匹配的耗材，如 DLAB Accurate 96 推荐使用 0.1mL 标准管或 0.2mL 矮管（Low profile），白管、透明管均可。实验证明，由于 0.1ml 管比 0.2ml 管高度更低，一方面光程更短，灵敏度更高；另一方面，矮管中反应体系上方的空间相对更小，热传导效率提高，减少了蒸发带来的影响，荧光信号值更稳定。检测器从顶部扫描，所以白管和透明管均可使用，由于白管可有效阻止荧光折射出管或传递至加热模块，减低背景噪音，效果会更好。2）管盖/覆膜

采用检测器从顶部扫描的 QPCR 仪，均需选择透明管盖或光学密封膜，高质量的管盖或覆膜也可以提高检测灵敏度及稳定性。

3）分液

为了提高准确性和平行孔之间的重复性，建议初次分液前先用待分液试剂润洗枪头，减少误差。

04、加入模板加入模板操作需要在独立的样本区进行，防止污染。加入模板的体积不能太小，如＜2ul，容易放大移液误差，导致平行样本重复性较差，若模板浓度较高，可考虑稀释后再加入。加盖或覆膜后必须瞬时离心，防止液体挂壁及气泡影响实验准确性。

05 、上机测试

1）设置样本信息

样本设置信息与检测要求保持一致，按照检测试剂盒说明书设置信息，包括位置，荧光通道，基因名，样本名等；

2）程序设置

扩增曲线延伸阶段（两步法为退火延伸阶段）必须设置荧光采集点「End Point」，否则实验过程不采集荧光，得不到扩增曲线。

TIPS

实验结束后的 PCR 反应液是最大的气溶胶污染源，所以请集中处理，不要在试验区随意开盖哟~

注意以上每个实验操作环节，你就能得到漂亮的曲线啦！